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​​​​​​​Microscopía Básica—Una Destreza Importante para Fitopatólogos (Español)​

Riley, M. 2003. Microscopía Básica - Una Destreza Importante para Fitopatólogos. Trans. José Carlos Ureta R. 2008. The Plant Health Instructor. DOI: 10.1094/PHI-I-2008-0715-01

Melissa B. Riley, Department of Plant Pathology and Physiology, Clemson University

Traductor: José Carlos Ureta R. Departamento de Protección Vegetal – Facultad de Ciencias Agropecuarias, Universidad de Panamá, Panamá.

OBJETIVOS:

• Familiarizar al estudiante con los componentes de los microscopios comúnmente utilizados por fitopatólogos.
• Enseñar el cuidado y mantenimiento apropiado de los microscopios.
• Aprender los pasos de un adecuado manejo del enfoque y observación de especimenes con los microscopios.
• Determinar la magnificación de los microscopios.

INTRODUCCIÓN:

Usted va a embarcarse en la aventura de su vida en el laboratorio de fitopatología. El microscopio es una de las herramientas más útiles que tiene un fitopatólogo, cuando trata de identificar al agente causal de una enfermedad en plantas. Algunas veces el microscopio le brindará información que le permitirá conocer exactamente la causa de una enfermedad en plantas. En otros casos, pueden ser importantes para determinar que ciertos fitopatógenos no están causando un problema fitopatológico.

El uso adecuado de un microscopio es una de las destrezas más importantes que debe aprender un estudiante que se inicia en el estudio de la fitopatología. Los microscopios se desarrollaron a finales del siglo XVII y hoy en día, continúan siendo importantes para la identificación de hongos y algunos otros agentes causales de enfermedades en plantas. Aunque el estudio de los microscopios se les ha enseñado en sus cursos introductorios de las materias científicas, frecuentemente los estudiantes no aprenden como utilizarlos y cuidarlos adecuadamente. Es más, en ciertos cursos se les indica que los microscopios ya están preparados e instalados en su sitio y que no se les recomienda que cambien nada de lo ya establecido, fuera de efectuar el enfoque correspondiente. Esta publicación les proveerá con información básica e instrucciones en como preparar, usar y cuidar de microscopios, técnicas esenciales para estudiantes de Fitopatología.

Figura 1. Partes de un Microscopio Compuesto. Haga clic en imagen para una visión más detallada.

Figura 2. Partes de un Microscopio de Disección. Haga clic en imagen para una visión más detallada.

Dos tipos de microscopios son usados comúnmente en el curso introductorio de fitopatología. Estos microscopios son el microscopio compuesto (Figura #1) y el microscopio de disección (Figura #2). Este último es usado frecuentemente para la observación de objetos más grandes y generalmente presentan magnificaciones menores a los 100X. La fuente de luz se ubica en la parte superior o puede ser transmitida a través de la platina (traslúcida). Los microscopios compuestos son utilizados para la observación de especimenes más pequeños, los cuales son colocados sobre portaobjetos y cubiertos con un cubreobjetos. Los especimenes a observar deben dejar pasar la luz a través de ellos, en cierta medida, para que la luz llegue a los lentes del microscopio. La magnificación comúnmente encontrada en los microscopios compuestos está entre los 10X a 1000X.

Componentes de esta práctica incluyen a:

• PARTES DEL MICROSCOPIO.
• COMO MOVER Y TRANSPORTAR LOS MICROSCOPIOS EN FORMA APROPIADA.
• DETERMINACIÓN DE LA MAGNIFICACIÓN.
• AJUSTE DE LAS PIEZAS OCULARES.
• COLOCACIÓN Y ENFOQUE DE ESPECÍMENES EN UN PORTAOBJETOS.
• ORIENTACIÓN DE LOS ESPECÍMENES EN UNA PLACA.

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MATERIALES:

• Microscopio Compuesto.
• Microscopio de Disección.
• Portaobjetos y Cubreobjetos.
• Tijeras.
• Botella de agua con gotero.
• Aceite de Inmersión.
• Letras “e” escritas en un tamaño de letra #6 e impresas en papel blanco, luego se reduce a un 50% sobre un acetato que puede ser cortado en letras “e” individuales para cada estudiante (tamaño final de la letra “e” es 0.6 x 0.45 mm)

PROCEDIMIENTO:

PARTES DEL MICROSCOPIO.
Se debe familiarizar con las distintas partes de los microscopios antes de utilizarlos, porque se necesitará conocer en donde se ubican las mismas en los diferentes microscopios. Algunos de estos componentes pueden ubicarse en sitios ligeramente diferentes dependiendo del modelo de microscopio de que se trate. Tómese algunos minutos para estudiar las figuras 1 y 2 antes de proceder. Las principales partes del microscopio compuesto y del de disección y sus usos se encuentran establecidas en la Tabla 1. Anote las diferencias entre estos microscopios antes de continuar.

Pregunta: ¿Qué componentes están presentes en el microscopio compuesto que no están presentes en el microscopio de disección, tome como base las figuras 1 y 2?

Pregunta: ¿Qué componentes están presentes en el microscopio de disección que no están presentes en el microscopio compuesto?

COMO MOVER Y TRANSPORTAR LOS MICROSCOPIOS APROPIADAMENTE.
Los microscopios a menudo se almacenan en anaqueles cuando no se encuentran en uso. Para retirar los microscopios de los anaqueles, coloque una mano alrededor del brazo y la otra mano debajo de la base del microscopio. Siempre transporte en el laboratorio, de un sitio a otro, el microscopio en posición vertical y frontal. Transportar al microscopio en otra forma podrá ocasionar que se caigan o desprendan alguna de sus partes. Tenga cuidado de que el cordón eléctrico no se encuentre enredado con el de otro microscopio. Coloque el microscopio sobre una superficie limpia sobre el escritorio o mesa de laboratorio.

Las fuentes de luz se requieren para la mayoría de los microscopios. El cordón eléctrico de la fuente lumínica debe ser insertado en una salida eléctrica adecuada. En algunos modelos de microscopios de disección la fuente de luz es una unidad separada. Esta fuente de luz puede ser insertada en un espacio que presenta el brazo para poder iluminar la muestra desde arriba, en dirección hacia la platina. Alternativamente, la fuente de luz puede ser colocada cerca de la platina a nivel de la muestra o debajo de la platina.

Pregunta: ¿Nota alguna diferencia entre el microscopio compuesto asignado y el ilustrado en la figura 1? Si es el caso, anote la localización diferente de las partes y si existen partes distintas a las observadas en dicha figura.

Pregunta: ¿Nota alguna diferencia entre el Microscopio de Disección asignado y el ilustrado en la figura 2? Si es el caso, anote la localización diferente de las partes y si existen partes distintas a las observadas en dicha figura.

DETERMINACIÓN DEL AUMENTO.
El aumento es una medida de la capacidad del microscopio de agrandar una imagen. La resolución es una medida de la capacidad del microscopio para separar los diferentes puntos de una imagen. Determinar el aumento es vital cuando se comparan los tamaños de los diferentes objetos a observarse con la ayuda de un microscopio. Anote el aumento de los lentes oculares y objetivos de su microscopio. El aumento está impreso o grabado a un lado de los objetivos y oculares o en la parte superior en el caso de los oculares. Este aumento se simboliza con un número seguido de una “X” (ejemplo, 15X) Los microscopios de disección pueden presentar lentes adicionales (referidos también como lentes auxiliares o suplementarios), en la base de la cubierta de los objetivos, para incrementar el tamaño de la observación. Anote si su microscopio de disección presenta estos lentes auxiliares. Además pueden tener también un botón que aumenta la imagen al moverse. Note que este botón presenta una numeración indicando el aumento que se esta utilizando.

Algunos microscopios compuestos a menudo presentan objetivos que sólo pueden ser utilizados con aceite de inmersión. Estos objetivos se identifican por tener grabada la palabra oil (aceite, en inglés) en un lado, cerca del número que indica el aumento del objetivo. Estos objetivos no pueden ser utilizados sin el aceite de inmersión. Los otros objetivos no deben ser usados con aceite de inmersión ya que se pueden dañar si son inmersos en este aceite. El uso de lentes de inmersión es esencial cuando se observan estructuras menores de 10 µm de tamaño. Por ejemplo, este aumento se requiere cuando se requiere determinar la forma de una célula bacteriana. El aceite de inmersión no incrementa el aumento de los lentes, pero mejora la resolución y la nitidez de la imagen producida por dicho objetivo. Cuando la luz pasa a través de un material a otro, por ejemplo del vidrio al aire, la luz se refracta o distorsiona. La luz de diferentes longitudes de onda se inclina a diferentes ángulos. Estas refracciones dan como resultado una distorsión la cual se manifiesta más a medida que el aumento del lente es mayor. Al colocar una gota de aceite de inmersión, el cual tiene el mismo índice de refracción que el vidrio, entre el objetivo de 100X y el portaobjetos (placa) se reduce significativamente la dispersión de la luz que ocurriría sino se utiliza el aceite de inmersión. Por ello, se incrementa la resolución de la imagen.

Para determinar el aumento de cualquier imagen se necesita multiplicar el aumento del ocular por el aumento del objetivo. Si existen lentes auxiliares en un microscopio de disección, el aumento debe ser multiplicado por el del ocular y el del objetivo. Es importante anotar los diferentes aumentos utilizados para poder comparar el tamaño relativo de las imágenes que se observen. En muchos casos se requerirá de usar uno o varios aumentos para observar todos los detalles de la muestra.

Pregunta: ¿Cuál es el aumento de los oculares de su microscopio compuesto y de disección?
Microscopio compuesto: _______________
Microscopio de Disección: _______________

Pregunta: ¿Cuál es el aumento de los objetivos de su microscopio compuesto? ____________, ____________, ____________, ____________

Pregunta: ¿Su microscopio compuesto tiene objetivo de inmersión? _______________

Pregunta: ¿Cuál es su aumento? ___________

Pregunta: ¿Cuál es el máximo aumento que puede obtener con su microscopio compuesto? ________________
¿Con el uso de aceite de inmersión? ____________
¿Sin el uso de aceite de inmersión? _____________

Pregunta: ¿Su microscopio de disección tiene lentes auxiliares o suplementarios en la parte inferior de la cobertura de sus objetivos, (Figura 3)? _______. ¿Si es así, cuál es el factor de aumento? __________.

Figura 3. Localización de los lentes auxiliares (Cortesía de M. B. Riley)

Figura 4. Botón de aumento a un costado del microscopio de disección usado para incrementar/disminuir el aumento. (Cortesía de M. B. Riley)

Pregunta: ¿Cuál es el aumento mínimo y máximo que se puede obtener, cuando se usa el ajuste asociado a su botón de aumento (zoom) localizado a un costado de su microscopio de disección (figura 4)?

Pregunta: ¿Cuál es el máximo aumento disponible cuando se utiliza su microscopio de disección? Recuerde incluir el factor que representa los lentes auxiliares o suplementarios, si están presentes en su microscopio, y el máximo para el ajuste de aumento y oculares.

Figura 5a. Métodos de ajuste del ancho de los oculares A: Botón entre los oculares, se mueve para ajustar el ancho.

Figura 5b. Simplemente se empuja o hala a los lados, en donde se sostiene los oculares para ajustar el ancho. (Cortesía de M. B. Riley)

AJUSTE DE LAS PIEZAS OCULARES.
Se requieren de varios ajustes antes de observar a los especimenes. En microscopios bioculares (con dos oculares) la distancia entre ellos se debe ajustar acorde a su distancia interpupilar y con ambos ojos observar una sola imagen. Existen diferentes formas de ajustar la distancia, dependiendo del microscopio que se este utilizando. En algunos microscopios existe un botón entre los oculares que ajusta la distancia entre éstos. (Figura 5A). Otros microscopios se ajustan moviendo los oculares (Figura 5B). Dicho ajuste es específico para cada persona, por ello se requieren de ajuste mínimos cuando una persona ha utilizado previamente el microscopio. Haga este ajuste previo a iniciar la observación. Los diferentes ajustes son necesarios para una mejor observación y que no se presenten incomodidades y fatiga de sus ojos al efectuar las observaciones pertinentes. Este procedimiento de ajuste se realiza una vez se vaya a iniciar la observación de la placa correspondiente.

COLOCACIÓN Y ENFOQUE DE ESPECÍMENES EN UN PORTAOBJETOS.
Lo primero que se debe considerar es la colocación de la placa y el enfoque. Para proceder se obtiene una letra "e" que se proveerá al inicio. Después de enfocar la letra "e", se iniciará la ilustración respecto al movimiento y orientación del material a observar en la placa.

1. Corte alrededor de 0.5 centímetros alrededor de la letra "e".
2. Coloque una gota de agua sobre el portaobjetos y marque uno de los dos lados largos del mismo.
3. Coloque la letra "e" sobre el portaobjetos de modo que la parte superior de la letra esté en dirección a la marca en el portaobjetos.
4. Con un cubreobjetos sostenido con los dedos por los bordes, coloque uno de los bordes cercano a la letra "e" y suavemente deje caer el otro extremo del cubreobjetos sobre la letra "e", de modo que le agua de la gota se disemine debajo del cubreobjetos. Seque cualquier exceso de agua con papel toalla. La letra "e" debe de esta manera permanecer en posición para ser observada con su microscopio.
5. Asegúrese de que su microcopio compuesto este en posición de poder realizar una observación adecuada a través de los oculares, según sea necesario. Además debe estar conectada la fuente lumínica o si la luz está incorporada en el microscopio, el mismo este conectado y encendido. Tenga cuidado de que el cordón eléctrico esté en una posición que no interrumpa el paso ni la observación de otros.

Figura 6. Botón de ajuste del micrométrico utilizado para proporcionar un mayor acceso a la platina y el ajuste inicial de la imagen. (Cortesía de M. B. Riley)

6. Levante el cabezal utilizando el tornillo macrométrico para iniciar la observación (Figura 6). En algunos casos la platina es la que se mueve y no el cabezal.

Figura 7. Rotación del revólver para colocar en posición al objetivo deseado. (Cortesía de M. B. Riley)

7. Rote el revólver para iniciar la observación con el objetivo de menor aumento, usualmente 4x o 10x, según sea el caso (Figura 7).

Figura 8. Perilla del condensador para ajustar el nivel de luz que pasa a través de la muestra. (Cortesía de M. B. Riley)

8. Usando la manija de abertura del diafragma, abra el mismo a aproximadamente la mitad de su capacidad de abertura. (Figura 8).
9. Coloque la placa sobre la platina con la marca en la placa a su lado opuesto. Coloque la letra "e" directamente por encima del centro del condensador que se encuentra ubicado debajo de la platina y que puede ser observado a través de la abertura que presenta la platina.

Figura 9. Botón para subir y bajar el condensador. (Cortesía de M. B. Riley)

10. Utilizando el botón respectivo, levante el condensador, hasta que la punta del mismo se encuentre a una distancia de la placa de aproximadamente el grosor de una lámina de papel toalla. (Figura 9).

Figura 10. Botón del ajuste del micrométrico usado para obtener el enfoque máximo. (Cortesía de M. B. Riley)

11. Rote el tornillo micrométrico a una posición aproximada de su punto medio. (Figura 10).
12. Rote el tornillo macrométrico hasta que la placa casi toque el objetivo. Asegúrese de observar desde lado del microscopio mientras alcanza la distancia de observación. No se recomienda forzar el objetivo dentro de la placa ya que la rompería o más importante aún se dañaría el objetivo.
13. Utilizando su ojo y ocular derecho, suavemente mueve el tornillo macrométrico hasta que este enfocada la letra “e”. Ajuste su visión hasta observar el mejor enfoque posible.
14. Luego use el tornillo micrométrico hasta obtener la imagen más nítida posible. (Figura 10). Si más de un apersona está utilizando el microscopio, cada una de ellas necesitará de efectuar este ajuste en su visión.
15. Sin mover el enfoque efectuado con el ojo derecho, observe la letra “e” con el ojo y ocular izquierdo. Use el ajuste de dioptría moviendo en sentido contrario a las manecillas del reloj, del ojo izquierdo hasta que se observe fuera de foco la letra “e”. Posterior a ello, mueve el ajuste de dioptría en sentido de las manecillas del reloj hasta que se obtenga un enfoque nítido. Este ajuste reducirá el agotamiento del ojo.
16. Ahora se procederá a efectuar las observaciones de su espécimen

ORIENTACIÓN DE LOS ESPECÍMENES EN UNA PLACA.
El efectuar dibujos lo más preciso posible de sus observaciones es extremadamente importante. Estos dibujos serán de mayor importancia, especialmente cuando se están haciendo comparaciones de dibujos efectuados en diferentes períodos. Sería adecuado trazar un círculo que representa su área de observación al microscopio y luego añada un rayado tenue dentro del círculo que le sirva de guía (lugar y tamaño), anote el aumento que se está utilizando al momento de efectuar sus dibujos.

Indicación: Dibuje lo que observa. Observe la parte superior de la letra “e” vista desde el microscopio.

Pregunta: ¿Cómo es la posición de la parte superior de la letra “e”, si se le compara con la observación efectuada cuando no se está utilizando el microscopio? ¿Son diferentes? ¿Es ésto importante?

Pregunta: ¿Si se necesita observar hacia el lado izquierdo de la muestra, hacia que dirección se necesita mover la placa? _______________________

Pregunta: ¿Si se necesita observar la parte superior de su muestra, hacia que dirección necesita mover la placa? ________________________

Pregunta: ¿Por qué lo anterior es importante? _________________________

17. Para incrementar el aumento se procede como sigue: Asegúrese de que su muestra está enfocada correctamente con el objetivo de más bajo poder utilizado en un momento dado.
18. Mientras observa el objetivo, asegúrese de que su movimiento no toque la placa y se deslice adecuadamente, mueve el revólver al siguiente objetivo de superior aumento y que esté en la posición correcta sobre la muestra. La mayoría de los microscopios tienen posiciones en donde el objetivo, si está colocado adecuadamente, hace un ruido seco o chasquido. Si la luz no se observa o el círculo de luz no está centrado, coloque el revólver en la posición correcta.
19. Use el tornillo micrométrico para que sea nítida su observación. No debiera tener que utilizar el tornillo macrométrico, si el enfoque anterior fue el adecuado.
20. Si se necesita incrementar los aumentos se repiten los pasos 17 a 19.

Figura 11. Adición de aceite de inmersión previo al cambio al lente de inmersión. Observe que el revólver se encuentra a media distancia entre los objetivos, siendo el lente de inmersión uno de ellos. (Cortesía de M. B. Riley)

21. Si se necesita usar aceite de inmersión, se requiere usar una gota del mismo en la placa, en el sito que se desea observar. (Aceite mineral u otros aceites no deben ser utilizados). Al mover el revólver hacia la posición del objetivo de inmersión, deténgase a media distancia entre el objetivo anterior y el de inmersión. (Figure 11).
22. Añada la gota de aceite de inmersión sobre el centro de la placa en observación.
23. Mueve el revólver de manera que el objetivo de inmersión esté directamente sobre la placa. La gota de aceite de inmersión debe formar un “puente” entre el objetivo y la placa.
24. Use el tornillo micrométrico para observar una imagen nítida de su muestra.
25. Tal vez se requiera de ajustar el condensador, incrementando o disminuyendo la cantidad de luz que proviene del condensador utilizando la manija del diafragma. (Figura 8).
26. Nota importante: Asegúrese de que los otros objetivos no se impregnen de aceite de inmersión, ya que se pueden dañar.
27. Cuando termine la observación con el lente de inmersión, levante el cabezal o baje la platina, según sea el caso de acuerdo a su microscopio, limpie de inmediato el objetivo del aceite adherido y remueva la placa con el aceite. Limpie el aceite de las placas si se van a volver a utilizar o si son placas permanentes de laboratorio. Los objetivos se pueden limpiar con papel de lente u agua destilada. Solamente use papel de lente para limpiar los objetivos ya que otros materiales como, papel toalla, toallitas, otros, pueden dañarlos.
28. Cada vez que se requiera de remover una placa, siempre levante el cabezal o baje la platina, para posteriormente remover la placa observada. Para evitar que de manera descuidada se dañe el objetivo al rozarlo con la placa.

Pregunta: ¿Nota las diferencias en la observación de la letra “e” a medida que va pasa a un aumento superior o diferente? _________________________

USO DEL MICROSCOPIO DE DISECCIÓN:
Existen varias diferencias entre un microscopio compuesto y un microscopio de disección (algunas veces se le denomina estereo microscopio, debido a que es como dos juegos de microscopios para enfocar en un punto, proveyendo una observación tridimensional o vista estereoscópica del espécimen). Generalmente la mayoría de los microscopios de disección no poseen un botón de ajuste micrométrico. La fuente de luz (iluminador) puede estar separada del microscopio y puede ser colocada en el brazo, debajo de la platina o a nivel de la platina. Se le harán recomendaciones específicas para el tipo de microscopio que se maneja en el laboratorio. Muchos microscopios de disección no tienen objetivos separados para incrementar el aumento, pero tienen un botón de aumento (zoom) que puede aumentar o disminuir dicho aumento. Nota: Algunos microscopios de disección tienen además lentes auxiliares o suplementarios en la parte inferior de la cubierta de los objetivos o del cabezal. Si estos lentes se encuentran presentes deben ser incluidos en la determinación del aumento.

Las muestras son colocadas sobre la platina y se les mueve a mano. La luz puede ser transmitida a través de la placa, ajustando el espejo debajo de la muestra o la muestra puede observarse con luz proveniente de la parte superior. Use los pasos que se indican a continuación, ignorando a aquellos que no aplican para su microscopio.

Figura 12. Microscopio de disección con la fuente de luz posicionada de manera tal que es transmitida hacia arriba desde la parte inferior a través de la muestra. A – Eje giratorio del espejo usado para ajustar el ángulo del espejo para reflejar la luz. (Cortesía de M. B. Riley)

Para observar la letra “e” es mejor usar la luz proveniente de la parte inferior de la muestra .

1. Corte alrededor de 0.5 centímetros alrededor de la letra "e".
2. Coloque una gota de agua sobre el portaobjetos y marque uno de los dos lados largos del mismo.
3. Coloque la letra "e" sobre el portaobjetos de modo que la parte superior de la letra esté en dirección a la marca en el portaobjetos.
4. Con un cubreobjetos sostenido con los dedos por los bordes, coloque uno de los bordes cercano a la letra "e" y suavemente deje caer el otro extremo del cubreobjetos sobre la letra "e", de modo que le agua de la gota se disemine debajo del cubreobjetos. Seque cualquier exceso de agua con papel toalla. La letra "e" debe de esta manera permanecer en posición para ser observado con su microscopio.
5. Coloque la placa con la letra “e” sobre la platina con la parte superior de la letra del lado opuesto al suyo, la marca en la placa también debe estar colocada en el sentido contrario al suyo.
6. Ajuste el eje giratorio del espejo para que la luz se transmita a través de la muestra, luego utilice el botón de enfoque para la observación adecuada de la letra “e”.
7. Dibuje la orientación de la letra "e" dentro del círculo.

Pregunta: ¿Existe alguna diferencia entre lo que se observó anteriormente con el microscopio compuesto? ¿Si es así, cuál/es son las diferencias? __________________________

8. determine el aumento de su muestra usando la fórmula siguiente:

Aumento Total = Ocular X Lente Auxiliar X Graduación en el Botón de Ajuste de Aumento (zoom).
________   =   ________   X   ________   X   __________

9. ¿Cuando se mueve la muestra de derecha a izquierda o de arriba hacia abajo y viceversa, en que dirección se mueve la imagen observada a través del microscopio de disección? ________________

Pregunta: ¿Es esta observación distinta o igual a la observación registrada con el microscopio compuesto?

Pregunta: ¿Cuándo utilizaría la fuente de luz que provenga de la parte superior del microscopio? Y, ¿Cuál es la ventaja de esta posición? ________________________

Después de que ha terminado esta práctica, recuerde el almacenamiento adecuado de su microscopio dentro del anaquel o mueble. Asegúrese de que los objetivos estén limpios y que se hayan removido de la platina la placa en observación. Apague la fuente lumínica. Desconecte el cordón eléctrico y enróllelo adecuadamente. Remueva la fuente de luz asociada a los microscopios de disección. Coloque todos los microscopios y luces dentro de los lugares de almacenamiento adecuados. Se le pueden proveer otras instrucciones según sea la necesidad.

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Obtenga las respuestas a las preguntas del ejercicio (en inglés)​​

REFERENCIA ÚTIL Y COMPLEMENTARIA:

http://www.microscopyu.com - Este es el sitio de la red (página web ) para los microscopios marca Nikon – contiene artículos relevantes y tutoriales (en inglés), al igual que imágenes de microscopios. También incluye el desarrollo técnico relacionado a nuevas técnicas de microscopia y microscopios.